日常工業(yè)生產中，退火爐的退火溫度是由引物的GC%含量決定的，但是反應體系的條件改變也會影響引物的退火溫度（如Mg,Na等離子濃度）。pcr在模板變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃(某個退火溫度)的時候，可使引物和模板發(fā)生結合。由于模板DNA 比引物復雜的多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞，這就使PCR后期的過程成為可能。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。
另一種說法：熔解溫度（Tm）是引物的一個重要參數。這是當50％的引物和互補序列表現為雙鏈DNA分子時的溫度.Tm對于設定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火爐溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的 Tm低5℃。設定Tm有幾種公式。有的是來源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的引物。有的是根據GC含量估算Tm。確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結構和相鄰堿基的特性預測引物的雜交穩(wěn)定性。大部分計算機程序使用近鄰分析法。 Tm值除了用軟件之外，還可以這個公式：2（A+T）+4（C+G），然后減5—10度根據所使用的公式及引物序列的不同，Tm會差異很大。因為大部分公式提供一個估算的Tm值，所有退火溫度只是一個起始點。可以通過分析幾個逐步提高退火溫度的反應以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產物的形成。
為獲得最佳結果，兩個引物應具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃，就會引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設定為比最低的Tm低5℃ 或者為了提高特異性，可以在根據較高Tm設計的退火溫度先進行5個循環(huán)，然后在根據較低Tm設計的退火溫度進行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。
另外，由于PCR儀的不同，注意其退火溫度的設定：一般的PCR儀允許設置跨度12-15度的梯度范圍，所以你的梯度范圍盡可能設置寬一點，爭取一輪梯度就可以確定最佳可用退火溫度。具體從多少度到多少度，要看你這對引物的Tm值，如果兩個引物Tm值不高，可以設置48-60的梯度；否則可以設置58-70度的梯度；如果兩個引物的Tm中等，則可以設置53-65的梯度范圍，具體情況靈活掌握。傳統(tǒng)梯度PCR儀中是可以放置12個樣品進行梯度的，需要注意的是每個相鄰兩孔間的溫度差異是不等的，尤其是第2、3孔與第1孔接近，第10、11孔與第12孔接近。可以舍棄第2、2、10、11孔，只在第1、4、5、6、7、8、9、12孔中放置共8個樣品，孔間溫度變化幾乎呈真正的梯度狀。

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